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变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)
发布日期:2017-02-28

变性梯度凝胶电泳系统(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)最初是 Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的,起初主要用来检测 DNA 片段中的点突变。Muyzer 等人在 1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究。后来又发展出其衍生技术,温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)。此后十年间,该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域,目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。

 

DGGE原理:

双链 DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时,其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA 片段能够被区分开,但同样长度的 DNA 片段在胶中的迁移行为一样,因此不能被区分。DGGE/TGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上,加入了变性剂(尿素和甲酰胺)梯度或是温度梯度,从而能够把同样长度但序列不同的 DNA 片段区分开来。一个特定的 DNA 片段有其特有的序列组成,其序列组成决定了其解链区域(melting domain, MD)和解链行为(melting behavior) 。一个几百个碱基对的 DNA 片段一般有几个解链区域,每个解链区域有一段连续的碱基对组成。当温度逐渐升高(或是变性剂浓度逐渐增加)达到其最低的解链区域温度时,该区域这一段连续的碱基对发生解链。当温度再升高依次达到各其他解链区域温度时,这些区域也依次发生解链。直到温度达到最高的解链区域温度后,最高的解链区域也发生解链,从而双链 DNA 完全解链。不同的双链 DNA 片段因为其序列组成不一样,所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。当它们进行 DGGE/TGGE 时,一开始温度(或变性剂浓度)比较小,不能使双链 DNA 片段最低的解链区域解链,此时DNA 片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。然而一旦 DNA 片段迁移到一特定位置,其温度(或变性剂浓度)刚好能使双链 DNA 片段最低的解链区域解链时,双链 DNA 片段最低的解链区域立即发生解链。部分解链的 DNA 片段在胶中的迁移速率会急剧降低。因此,同样长度但序列不同的 DNA 片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度,因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降,从而在胶中被区分开来。然而,一旦温度(或变性剂浓度)达到 DNA 片段最高的解链区域温度时,DNA 片段会完全解链,成为单链 DNA分子,此时它们又能在胶中继续迁移。因此如果不同 DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时,这些片段就不能被区分开来。在 DNA 片段的一端加入一段富含 GC 的 DNA 片段(GC 夹子,一般 30-50个碱基对)可以解决这个问题。含有GC夹子的 DNA 片段最高的解链区域在 GC 夹子这一段序列处,它的解链温度很高,可以防止 DNA 片段在DGGE/TGGE 胶中完全解链。当加了 GC 夹子后,DNA 片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开。当用DGGE/TGGE 技术来研究微生物群落结构时,要结合PCR(polymerase chain reaction)扩增技术,用 PCR 扩增的 16S rRNA 产物来反映微生物群落结构组成。通常根据16S rRNA 基因中比较保守的碱基序列设计通用引物,其中一个引物的 5’-端含有一段 GC 夹子,用来扩增微生物群落基因组总 DNA,扩增产物用于DGGE/TGGE 分析。DGGE/TGGE 有两种电泳形式:垂直电泳和水平电泳。前者是指变性剂梯度或温度梯度的方向和电泳方向垂直;后者是指两个方向是平行的。在分析微生物群落的 PCR 扩增产物时,一般先要用垂直电泳来确定一个大概的变性剂范围或温度范围。垂直电泳时,胶从左到右是变性剂梯度或温度梯度。在胶的左边,变性剂浓度或温度低,DNA 片段是双链形式,因此沿着电泳方向一直迁移。在胶的另一边,由于变性剂浓度或温度高,DNA 一进入胶立刻就发生部分解链,因此迁移很慢。在胶的中间,DNA 片段有不同程度的解链。在变性剂浓度或温度临界于DNA 片段最低的解链区域时,DNA 的迁移速率有急剧的变化。因此,DNA 片段在垂直胶中染色后呈 S 形的曲线,根据垂直电泳确定的范围,再用水平电泳来对比分析不同的样品。在用水平电泳分析样品之前,先要优化确定电泳所需时间。一般采用时间间歇(timetravel)的方法,即每隔一定时间加一次样品,从而使样品的电泳时间有一个梯度,根据这个结果,确定最佳的电泳时间。通过各种染色方法可以看到DGGE/TGGE 胶中的 DNA 条带。最常用的几种染色方法是溴化乙啶(ethidium bromide, EB),SYBR GreenI, SYBR Gold 和银染法。EB 法染色的灵敏度最低。SYBR Green I 和 SYBR Gold 相比 EB,能更好地消除染色背景,因此它们的检测灵敏度比 EB 法高很多。EB 和 SYBR 染色时,双链 DNA 能很好地显色,单链 DNA 基本上不能显色。银染法的灵敏度最高,它不但能染双链 DNA,也能染单链 DNA,但它的缺点是不能用于随后的杂交分析。

 

PCR-DGGE/TGGE 在微生物生态学中的应用:

PCR-DGGE/TGGE 技术在微生物生态学中的一个主要用途是分析微生物群落结构组成Muyzer 等人于1993 年首次将该技术用于研究微生物菌苔和生物膜系统的群落多样性(50)。此后,该技术被广泛应用于各微生物生态系统,包括土壤 ,活性污泥,人体和动物肠道,温泉,植物根系,海洋,淡水湖,油藏等。绝大部分研究都是通过扩增细菌或古细菌的 16S rRNA 基因来研究各生态系统中的细菌或古细菌群落多样性。也有用真菌的通用引物扩增 18S rRNA 基因 ,从而研究真菌的群落多样性。除了通过核糖体RNA 基因来分析微生物群落结构外,还可以通过扩增功能基因来研究功能基因及功能菌群的多样性。氨单加氧酶(ammonia monooxygenase gene,amoA)基因被用来研究氨氧化菌群;[NiFe]氢化酶基因被用来研究硫酸盐还原菌群; 多组分苯酚羟化酶大亚基基因( the largest subunit of the multi-component phenolhydroxylase,LmPH)被用来研究降酚菌群。PCR-DGGE/TGGE 技术的另一大优点是能快速同时对比分析大量的样品。因此它既可以对比分析不同的微生物群落之间的差异,也可以研究同一个微生物群落随时间和外部环境压力的变化过程。除了上述两个主要用途外,PCR-DGGE/TGGE 技术还有很多其他用途。它可以跟踪监测细菌的富集和分离,从而评价不同培养基及培养条件对分离菌种的影响;可以检测单个纯菌 rRNA基因的微异质性;可以用来比较不同的 DNA 提取方法;另外,它还可以辅佐筛选克隆文库以及检测 PCR和克隆过程中的偏差。我们实验室用 PCR-TGGE 技术研究了多个微生物生态系统的微生物群落,包括处理工业焦化废水的活性污泥系统,人体肠道,动物肠道(猪,熊猫,昆虫),人体口腔,纤维素降解土壤,油藏系统等。另外,我们还研究了处理工业焦化废水的活性污泥系统中苯酚降解菌群和氨氧化菌群的功能基因多样性。

 

DGGE/TGGE 技术的缺陷及优化:

在用分子生物学方法分析微生物群落结构组成时,有很多偏差。不同细菌的基因组大小和核糖体 RNA拷贝数不同;提取基因组总DNA 时细胞的裂解效率不同;DNA 提取和纯化时有偏差;PCR 扩增过程中有偏差。除了这些,在应用DGGE/TGGE 技术分析微生物群落结构组成时还有很多其他的缺陷。DGGE/TGGE 一般只能分析 500 个碱基对以下的 DNA 片段,因此得到的系统进化相关的信息就很少。在研究复杂环境生态系统(如土壤,人体肠道)时,其中微生物种类很多。但DGGE/TGGE 图谱中一般只有一二十个条带,这些条带反映的是群落中的优势菌群。一般只有在总的微生物群落中占 1%以上的种群才能被检测出来,系统中的弱势菌群不能被检测到。为了降低分析群落多样性时的复杂度,一种方法是先根据 GC 含量的不同,将基因组总 DNA 分成各个部分,再分别 PCR-DGGE/TGGE 分析。另一个方法是使用类群特异性(group-specific)引物对基因组总 DNA 进行 PCR 扩增,再用于DGGE/TGGE 分析。在设计 PCR 引物去扩增某些特定菌群时,由于某些菌群的序列相互之间同源性不是很高,因此需要设计简并性引物。此时,相同的微生物会有 2 个条带,这会对微生物群落结构组成造成高估。另外,同一个细菌也可以有多个核糖体 RNA 操纵单元,它们的序列可以有微小差异,这也会高估微生物群落多样性。DGGE的电泳条件不一样,即使相同的样品所得的图谱也会有差异。在应用DGGE 时,如果所用电压太低,需要的电泳时间就很长,变性剂梯度会有变化,因此导致图谱也会有变动。另外,DGGE/TGGE 的一个很大的优点是可以对胶中所感兴趣的条带进行研究,得到它们的序列,从而可以直接获得和系统生态功能相关的微生物种群的系统进化信息。以前研究DGGE/TGGE 胶中单一条带序列组成的一个比较普遍的方法是先构建整个微生物群落的16S rRNA 克隆文库,然后再对文库中的克隆进行扩增,通过DGGE/TGGE 和原始样品的条带进行对比,能迁移到相同位置处的克隆的序列就是原始条带所含的序列。然而,已有研究表明,不同的 DNA 条带在DGGE/TGGE 胶中可以迁移到相同的位置,因此单一DGGE/TGGE 条带可能含有不止一种序列。这种情形在分析复杂环境样品时会更多。另一个研究DGGE/TGGE 胶中单一条带序列组成的方法是直接从胶中回收DNA,然后构建其克隆文库,再对其中的克隆进行测序。现在越来越多的研究人员采用后一种方法。然而,PCR 过程中产生的异源双链(heteroduplex)和单链 DNA(single-stranded DNA)也会对分析单一条带序列造成偏差。人们已经普遍意识到异源双链 DNA 会在DGGE/TGGE 胶中产生虚假条带,然而对单链 DNA造成的偏差还没有引起足够的重视。我们实验室以某处理工业焦化废水的活性污泥为研究对象,详细地分析了单链 DNA 在分析TGGE 胶中单一条带序列组成时所造成的影响,发现它会大大高估单一条带中的序列多样性。另外,我们还对比了 3 种去除单链DNA 的方法,发现变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(denatured polyacrylamide gel electrophoresis, d-PAGE)纯化的效果最好。我们建议在进行DGGE/TGGE 电泳之前,尤其是要分析单一条带序列时,要先用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR 产物进行纯化,然后再走电泳。

 

变性梯度凝胶电泳DGGE 操作步骤:

1、将海绵垫固定在制胶架上,把类似‘三明治’结构的制胶板系统垂直放在海绵上方,用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统,注意一定是短玻璃的一面正对着自己。

2、共有三根聚乙烯细管,其中两根较长的为 15.5cm,短的那根长 9cm。将短的那根与Y 形管相连,两根

长的则与小套管相连,并连在 30ml 的注射器上。

3、在两个注射器上分别标记‘高浓度’与‘低浓度’,并安装上相关的配件,调整梯度传送系统的刻度到适当的位置。

4、反时针方向旋转凸轮到起始位置。为设置理想的传送体积,旋松体积调整旋纽。将体积设置显示装置固定在注射器上并调整到目标体积设置,旋紧体积调整旋纽。例如16*16cm gels(1mm thick):设体积调整装置到 14.5。

5、配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液到两个离心管中。

6、每管加入 18 μl TEMED,80 μl 10%APS,迅速盖上并旋紧帽后上下颠倒数次混匀。用连有聚乙烯管标有‘高浓度’的注射器吸取所有高浓度的胶,对于低浓度的胶操作同上。

7、通过推动注射器推动杆小心赶走气泡并轻柔地晃动注射器,推动溶液到聚丙烯管的末端。注意不要将胶液推出管外,因为这样会造成溶液的损失,导致最后凝胶体积不够。

8、分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好,注意这里一定要把位置放正确! 再将注射器的聚丙烯管同Y 形管相连。

9、轻柔并稳定地旋转凸轮来传送溶液,在这个步骤中最关键的是要保持恒定匀速且缓慢地推动凸轮,以使溶液恒速的被灌入到三明治式的凝胶板中。

10、小心插入梳子,让凝胶聚合大约一个小时。并把电泳控制装置打开,预热电泳缓冲液到60℃。

11、迅速清洗用完的设备。

12、聚合完毕后拔走梳子,将胶放入到电泳槽内,清洗点样孔,盖上温度控制装置使温度上升到 60℃。

13、用注射针点样(预先准备好的活性污泥 16S rDNA V3 区 PCR 扩增产物,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化)。

14、电泳(200V,5h)。

15、电泳完毕后,先拨开一块玻璃板,然后将胶放入盘中。用去离子水冲洗,使胶和玻璃板脱离。

16、倒掉去离子水,加入 250 ml 固定液(10% 乙醇, 0.5% 冰醋酸)中,放置 15min。

17、倒掉固定液,用去离子水冲洗两次,倒掉后加入 250 ml 银染液(0.2% AgNO3,用之前加入 200μl 甲醛)中,放置在摇床上摇荡,染色 15min。

18、倒掉银染液,用去离子水冲洗两次,倒掉后加入 250 ml 显色液(1.5% NaOH, 0.5% 甲醛)显色。

19、待条带出现后拍照。

 

温度梯度凝胶电泳TGGE 操作步骤:

1、去离子水仔细洗涤制胶所用玻璃板,用纸巾擦干。再用酒精棉球擦一遍,用纸巾擦干。将支持膜夹在两块玻璃板之间,用夹子夹住,放置在桌上。

2、配胶 (每块胶配 5ml) 丙烯酰胺/双丙烯酰胺储存溶液(40%,37.5: 1):丙烯酰胺: 38.96g,双丙烯酰胺:1.03g 溶于 100 ml去离子水。

3、将玻璃板倾斜放置,用 1ml 的移液器将上面配置的胶慢慢灌入两玻璃板之间。将玻璃板水平放置半小

时以上,使胶凝固。

4、待胶凝固后,先用手拨去没有点样孔的玻璃板。用去离子水将支持膜背面冲洗干净,用纸擦干。再揭开

支持膜。

5、用 1ml 移液器在 TGGE 的温度面板(thermoblock)上加 800 μl 0.1% Triton。

6、用手抓住支持膜的两边,先将膜中部放于加热面板上,再慢慢将膜铺展开,在膜和加热面板间尽量不要

形成气泡。温度梯度方向和电泳方向一致。

7、将预先准备好的样品加入上样孔中,每孔最多加 3 μl 样品。

8、在胶的两端盖上 Waterman 滤纸(buffer wick),滤纸的另一端浸入电泳缓冲液中。

9、盖上盖子,预电泳(200V,7min)。

10、预电泳快结束时(6min 50sec),暂停反应。打开盖子,揭开滤纸。在凝胶中间慢慢盖上一层塑料膜(coverfilm)。再将滤纸盖在胶上,然后用一块玻璃板(coverplate with sealings)压在滤纸上。

11、盖上盖子,继续电泳(200V,3h)。

12、电泳结束后,终止程序。将支持膜取出,先用去离子水冲洗一次。

13、将膜转移至固定液(10% 乙醇, 0.5% 冰醋酸)中,放置 5min。

14、将膜转移至去离子水中冲洗一次,再转移至银染液(0.2% AgNO3,用之前加入 40μl 甲醛)中,放置在摇床上摇荡,染色 10min。

15、将膜在去离子水中冲洗 2 次,转移至显色液(1.5% NaOH, 0.5% 甲醛)中。

16、待条带出现后,将膜用去离子水冲洗 3 次,拍照。

 

注意事项:

1、配置试剂时一定要用去离子水,制胶洗膜时用的各个容器也要用去离子水洗涤干净,以防止氯离子污染。

2、制胶是实验的关键。在往玻璃板中灌胶时,要匀速地转动滑轮,将凝胶液匀速地灌入玻璃板。

3、灌完胶后,立刻清洗注射器,以防丙烯酰胺凝固,堵塞管子。

4、DGGE 的电泳缓冲液要超过“RUN”刻度线,不要超过“Maximam”刻度线。

5、点样时,要用小型注射器,伸入点样孔底部点样。

6、银染的整个过程中,一定要戴手套。以避免手接触胶而带来的污染。

7、每次用完仪器后要及时清理,清洗玻璃板培养皿等玻璃仪器。

 

其它:

1、配置试剂时一定要用去离子水,制胶洗膜时用的各个容器也要用去离子水洗涤干净,以防止氯离子污染。

2、保护层(protection foil)用来保护温度面板(gradient block),要防止试剂浸入,每次用完后要把残余的试剂吸干。一旦破损,应停止使用,更换后再继续使用。

3、TGGE mini system T1T2 之间的温度差不能超过 45℃。

4、支持膜和温度面板间一定要加 0.1% Triton,从而确保能形成稳定的温度梯度。

5、在铺支持膜于温度面板上时,要尽量避免气泡,否则会导致温度梯度不稳定。

6、如果要中途暂停或中断电泳,一定要在打开盖子前先关掉电源。

7、电泳过程中,不要触摸电极线和电泳缓冲液(高压!)。

8、从胶放到 gradient block 上到点样完毕要尽量快速,最好不要超过五分钟。

9、银染的整个过程中,一定要戴手套。以避免手接触胶而带来的污染。

10、每次用完仪器后要及时清理,清洗玻璃板培养皿等玻璃仪器。

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