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DGGE变性梯度凝胶电泳详解
发布日期:2017-01-21

简介

变性梯度凝胶电泳是人们多年来广泛使用的一种健全的检测点突变的方法(1)。它是一种基于PCR的方法,其原理是,与野生型基因相比,改变了PCR产物中突变序列的解链温度。通过PCR,致使DNA两个基因其中一个中的点突变变成不同的DNA的混合体。PCR后的产物中包括野生型基因和突变型基因。即同源二聚体。然而这两种产物的解链温度差别不大。在PCR反应的最后一个循环,形成另外一种产物,即异源双链DNA,它包括一条野生型的链和一条突变的链。DGGE的原理就在于同源PCR产物的解链温度远远低于异源PCR的产物,因为异源双链有一个错配。

为了看到同源和异源DNA的解链温度之间的差别,只要让其在含有变性剂尿素和甲酰胺的丙烯酰胺梯度凝胶上电泳即可。仅仅靠这些变性剂本身是不够的。另外,跑电泳的胶的温度也比较高,通常在60℃。电泳过程中,PCR产物在变性以前一直保持双链DNA的形式。一旦变性后,PCR产物将以单链DNA的形式继续跑,但是片段则会保留在变性的地方。为了达到这个目的,需要连上一个所谓的GC夹子以阻止完全变性。这个GC夹子是由40-60个单纯的鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸构成的一条链,然后连接在其中的一种PCR引物上。加上GC夹子进行PCR后的产物其一端具有很高的变性温度。因此,PCR产物在DGGE的胶上将部分变性。GC夹子保持双链。其余的片段形成“Y”形继续保留在胶上原来的地方。
2.操作步骤

2.1.设计PCR引物

对于DGGE来说,用于筛选点突变的PCR引物的解链特性是很关键的。当片段到达凝胶的临界点时,应该及时地变性,而不是在一端开始随着电泳的进行逐渐的慢慢的变性。这种慢性解链会形成模糊的条带或者斑点,将导致很难检测出突变。因为解链特性对于实验的成败至关重要,所以选取用来扩增目标产物的引物时必须格外小心。出于这个目的,为了选择引物,我们必须使用专门的软件来分析PCR可能产物的解链曲线。在这方面有各种各样的商业或者免费的平台软件可供使用。并且也有专门用来在线分析序列的网站。研究者在分析目标序列的时候通常都会得到一条不规则的解链曲线。但是连接上一个含40-60个核苷酸的GC夹子后往往会使曲线明显地变得平滑(see Fig. 2)。曲线的上下浮动范围应该在1℃以内。当然,GC夹子附近的解链温度很高。如果连接上GC夹子后曲线未变的平滑,那么我们应该尝试连到另一端。因为对于DGGE来说,GC夹子连接在引物的哪一端都可以。选择过程就是通过尝试各种不同的正反引物以获得曲线平滑的产物和适合PCR的引物。DGGE产物大多数在200-400bp。对于大于400bp的产物很难找到理想的解链曲线。
GC夹子的长度也会改变整个序列的解链过程。人们通常都使用含55个核苷酸的GC夹子,但是有时候也需要含60个核苷酸的,尤其是含GC丰富的序列。最终,通过计算机分析大多数目标序列都能获得好的平滑的曲线。然而,也有一些麻烦的序列需要使用特别的方法。例如,如果一段没有GC夹子的序列其解链曲线末端下降,这样可以再连接一个小一些的GC夹子。这叫做两极镶嵌。在这种极少的案例中我们可以在需要的地方使用一串8-20个核苷酸的序列。我们仍需特别注意富含GC的序列,因为这种序列在GC夹子开始的地方解链曲线并没有剧烈的变化,但是当接近GC夹子时解链温度开始上升。这里要说明的是,在引物上GC夹子之间增加一些A、T碱基,退火部分将会导致解链曲线剧烈的变化。

就向前面所说的,一个GC夹子包括40-60个鸟嘌呤和胞嘧啶。我们强烈建议在实践中使用已经被证实有效的一段序列作为GC夹子。设计你自己的GC夹子是很困难的,这或许将导致在PCR过程中形成稳定的发夹结构。许多解链预处理程序提供GC夹子的序列。制作一个带GC夹子的PCR引物并不需要专门的改变。操作规程与其它的PCR是一样的,并且退火和变性温度都没有变化。

变性梯度凝胶电泳非常适合筛选基因组DNA中的突变,因为大部分的外显子长度都小于400bp,可以作为一个片段来分析。因此用来筛选大的片段的许多方法对小的外显子来说用处不大。这些年来,根据许多基因的突变分析来看,很多突变都影响一致的剪接位点。因此,在外显子附近的内含子序列里的引物就会被选择,通过这种方式其剪接位点也将作为外显子的序列筛选出来。剩下的内含子与编码序列相比就不是隐藏有害的突变,而是更像包含无害的多态性片段。因此,在DGGE片段中我们应该尽量的减少内含子的序列。
2.2.呈现突变

为了分离同质双链和异源双链,DGGE片段需要经过丙烯酰胺凝胶。含有9%的丙烯酰胺凝胶可以保证清晰并且易于处理的条带。灌注这些凝胶,需要两种储备液:97.5:1丙烯酰胺/双丙烯酰胺 in 0.5XTAE和相同的储备液加上7M尿素和40%的甲酰胺。前者叫做0%变性剂,后者叫做100%变性剂。

100%到0%之间的梯度很少用到,因为在这么宽的梯度范围内同质双链和异源双链的变性点可能很接近,然而,设置一个30%的梯度却是很有必要的。为了选择尿素/甲酰胺梯度,一段序列的解链温度(Tm)通常根据由计算机分析得到的经验公式得到:TmX3.2-182.4=变性度%。通过增加或者减少计算得到的尿素/甲酰胺浓度的15%来获得需要的30%这个梯度,以使得解链点大概在凝胶的中心。具有不同尿素和甲酰胺梯度的丙烯酰胺凝胶是用底部有短管相通的两个容器组成的简单的梯度混合器倾注的。这种系统适用于倾倒各种梯度。
第一次电泳是在一种叫做time-travel的凝胶上进行的,在这种胶上,DGGE序列停留在泳道的15到20分钟时间间隔内。电泳跑完后,所有泳道变性的序列都应该停留在凝胶的相同高度,无论是什么时候加的。如果不是这种结果,那么这个系统就必须重新设计(see Fig. 3)。如果一条序列的条带不清楚或者在胶上停留的位置太靠前或者太靠后,那么这个梯度就应该调整。

从技术角度上来讲,DGGE实验最具有挑战性的问题是如何使电泳温度保持在60℃。有很多种方法可以使其温度达到60℃,但是最常用的是将盛有丙烯酰胺凝胶的玻璃槽放到一个恒温的热水器内。也有很多商用的可供DGGE的全部的配套设备,它们是用较低的缓冲室喷淋温水。通常都是在90V0.5XTAE缓冲液中电泳一宿,但是也可以用更高的电压在白天做短时间的电泳。电泳完后,胶要沉浸在含有EB的0.5XTAE的缓冲液中以呈现DNA条带。

3. DGGE的应用

变性梯度凝胶电泳是用来鉴定小的突变的一种方法,例如点突变。点突变是指一个核苷酸转移或者颠换到另一个上去。然而,许多类型的小突变例如缺失或者插入一个或者多个核苷酸都可以用DGGE鉴定出来。事实上,这些突变对于同质双链和异源双链都会引起解链温度的巨大差异,因此在胶上很容易就能看出来。
如前所述,DGGE可以鉴定200-400bp的序列,这使得它很方便的应用于分析基因组中的外显子。然而,DGGE也可以用来筛选RNA。但是,RNA比起DNA更加的容易降解,因此他需要先转化成cDNA。因此,为了诊断和研究基因遗传性异常,人们通常扫描基因组DNA突变。例如,DGGE被广泛的应用于结肠直肠癌的各种基因分析,像APC,MSH2,MSH6,MLH1等等。对于像结肠直肠癌这种可以治愈的潜在的致死性疾病症状前诊断特别重要。经过突变分析发现,患有结肠直肠癌的家族,基因突变通常都是唯一的。显然,检测一个家族的未知突变需要一种已经尝试并且证实有效的技术,例如DGGE,特别是当风险很高的时候。然而,出于研究目的,可靠性也是很重要的。要研究各种类型的突变需要这种检测技术能够反映出各种点突变,如此才可以做出突变范围的正确的分析报告。

进行性假肥大性肌营养不良是由X染色体上的一个编码抗肌萎缩蛋白的大型基因突变引起的。绝大多数的突变是大量的缺失或者重复,但是大约百分之三十的突变是发生在第70个外显子或者它们附近的结合位点上的点突变。为了加速筛选程序,PCR产物必须聚集起来,从三个到六个片段,然后在一条泳道上跑胶。当然,这种多路技术不仅仅限于大的基因。一个例子就是α胰岛素。使用二重扩增反应就可以筛选出整个的基因。两种反应的产物都可以在同一个胶上分析,这样可以快速地筛选大量的序列。

DGGE最初是用来轻松的诊断突变出现时的异源双链核酸。在筛选显性遗传病的基因突变时,PCR过程中形成异源双链DNA。然而,DGGE是否能应用于隐形遗传病?囊性纤维化是已知的最常见的隐形遗传病。自从1989年CFTR基因鉴定出来以后,突变诊断后显示,一些突变很频繁,最显著的是508位置的突变,三个核苷酸的缺失导致508位置色氨酸苯丙氨酸读码框的缺失。这种频繁的突变经常用其他的方法分析,以筛选已知的具体的突变。对于那些剩下的罕见的先前没有鉴定出来的突变,DGGE尤其适合。囊性纤维化是一个隐性基因,但这并不妨碍筛选,一个很简单的原因就是筛选的是患者的父母的DNA。他们的父母以杂合子的形式携带突变。尽管如此,筛选他们父母的基因没有太大的困难,因为在两个基因中很难同时出现稀缺突变。然而,我们必须注意的是由于地理或者自然条件的隔离,群体中的纯合稀缺突变也经常发现。即使这样,大多数的情况下,仔细的分析DGGE凝胶也将会发现纯合的突变。然而待测DNA也可以与正常的DNA混合以创建异源双链DNA。从技术的角度来看,隐形遗传和X连配错乱没有区别。此外,通常都是检测含杂合子的母亲的DNA。

检测点突变不仅仅局限于遗传错乱。它也适用于肿瘤。癌症是由于基因中的一系列的突变引起的,从整条染色体的缺失到点突变。手术上切除肿瘤并没有改变DNA的量,但是根据肿瘤和DNA分离的方法,DNA或许会被降解成小的片段。总之,这对于DGGE 方法来说并不是个难题,因为PCR片段通常都很小。另一个问题是肿瘤样品并不仅仅包含肿瘤细胞,其中也可能有血管和结缔组织。尤其是恶性肿瘤细胞可能导致样品中含有大量的未感染细胞。从经验来看,DGGE比其他方法更容易发现突变。在这种类型的研究中经常检测的典型基因有TP53、K-、N-和H-RAS。TP53基因上的突变检测通常受限于外显子5-8,人们认为这个区域隐藏了大部分的突变。然而,整个基因的突变分析显示这会导致忽略许多的突变。免疫组织化学常常被用来检查肿瘤中的p53的状态。研究者应该注意的是免疫组学化学和DGGE之间不能相互替代。在观察肿瘤中的p53时这两种方法是互补的。

DGGE的另外一个完全不同的应用是可以估计不同菌种的数量和种类。编码rRNA的基因被当作靶标,因为在不同的种之间这些基因高度保守。在绝大多数保守区退火的引物可以用来扩增完全不同种类的基因。在不是很保守的区域的片段序列变化DGGE可以显现出来并且可以用来鉴定不同的种。这种技术最早在微生态学中发展起来用来检测生活在土壤和水中的物种。这种方法也可以应用于评估生活在人类体内或者体外的物种。例如监测用抗生素治疗的病人。

检测点突变既可以用SSCP分析也可以用DGGE方法。这两种方法都有十多年的历史了,并且比起需要昂贵设备的最新的最先进的技术相对廉价。然而,什么时候用SSCP或者DGGE?DGGE是一种健全地方法,一旦优选一个产物,他将很有效。结果也很容易检测出来,因为只要放在紫外灯下一看就能立刻看到突变。清晰的结果是DGGE的一个巨大的优点。另外一个优点是它不需要放射性标记。SSCP需要放射性PCR或者银染,并且结果不够清晰。另一方面,SSCP比DGGE需要的时间少,并且不需要昂贵的材料。这就是为什么大量的样本用这种方法的原因。例如,筛选少量的样本要求用SSCP。DGGE适合于少选大量的长周期的样本。

当在胶上发现异常的条带后,很明显就能看出哪个样本上的哪个序列出现了变化。变化的的性质或者确切的位置是未知的。为此,必须对PCR产物进行测序。如果最后必须测序,为什么检测突变不直接测序而是选择DGGE?答案有两个。首先,DGGE结果很清楚。DGGE条带上的突变可以清楚的看到,然而测序需要成熟的软件和电脑分析后仔细乏味的检查。第二,也是决定性的因素,当筛选大量的样本时,DGGE成本较低。

引物选自外显子附近的内涵子序列,用来筛选整个的编码区和侧面的剪接位点。如果DGGE序列中含有相对大量的内含子片段,用DGGE来筛选基因组DNA中的外显子对于有些基因会比较的麻烦,因为内涵子序列中包含大量的多态性片段。用DGGE来筛选此类基因将会导致样本的条带异常,并且测序后大部分会显示多态性。研究者对于这类基因通常直接采取对样本测序以检测点突变。

如果想筛选大量的样本的未知突变,DGGE是个不错的选择。因为它不需要放射性标记,所以被认为是一种用户容易掌握的技术。再加上可靠性和低廉的成本都是DGGE的优势。

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